前言

2023年2月，中国科学院东北地理与农业生态研究所李向楠课题组（一作：李书鑫）在Environmental and Experimental Botany期刊发表的题为 “Visualized analysis of amino acids and organic acids in wheat caryopsis in response to multigenerational effects of elevated atmospheric CO2 concentration”（IF：6.028）的研究文章。目前，大气CO2浓度升高（e[CO2]）对小麦单代的影响已经有研究报道，但e[CO2]对小麦的多代效应在很大程度上是未知的。因此，在本研究中，运用基于AFADESI的空间代谢组学来探究多代e[CO2]暴露的小麦颖果中氨基酸和有机酸的空间分布。

【资料图】

中文标题：小麦颖果氨基酸和有机酸对多基因响应的可视化分析

研究对象：小麦

发表期刊：Environmental and Experimental Botany

影响因子：6.028

发表时间：2023年2月

运用组学技术：AFADESI-MSI空间代谢组学（由鹿明生物提供技术支持）

研究背景

二氧化碳浓度逐渐升高，对单一世代的植物如小麦、水稻等产生影响，如促进根系发育、增加叶面积、改变叶片形态、提高光合作用速率、减少水分流失、降低氮浓度和调节微生物群落组成。这种影响被称为e[CO2]，正常CO2浓度在研究中被称为a[CO2]，但e[CO2]在多代作物上的影响的深入理解是有限的，目前的研究发现，e[CO2]在进化变化中起着至关重要的作用。

小麦作为最重要的主食作物广泛分布于世界各地。e[CO2]对谷物产量和质量的影响并不总是同步的，基本机制仍然不清楚。有研究表明，二氧化碳增加后，小麦等C3植物的微量成分如N、Fe等水平下降，这可能是由于二氧化碳增加导致植物合成碳水化合物增加，也就是“碳水化合物稀释”。

在连续的e[CO2]下生长的四代后，小麦的总氨基酸浓度下降，从而影响人类健康。质谱成像技术（Mass imaging，MSI）有助于研究植物发育过程中复杂的代谢网络，它可以为进一步分析小麦颖果中的代谢物谱提供具体线索，特别是必需氨基酸。因此，本研究采用AFADESI空间代谢组技术对此展开研究。

研究思路

小麦胚芽和胚乳中受

多代e[CO2]暴露影响的综合代谢物集

为了确定e[CO2]暴露诱发的代谢重编程，在连续进行第七代CO2处理后，对小麦的胚芽和胚乳进行了原位代谢物的研究策略（图1B），共鉴定了161种不同的代谢物（图2A）。a[CO2]组中，有49个（4个上调，45个下调），差异代谢物类别有25种，如唑类、羧酸及其衍生物、生物碱及其衍生物等（图2B）。e[CO2]组中有43个（6个上调，37个下调），这些差异代谢物有20种，如唑类、羧酸及其衍生物、苯和取代的衍生物等（图2C）。

通过横向比较a[CO2]组和e[CO2]组的胚芽和胚乳发现，胚芽中有27中差异代谢物（6个上调，21个下调），分为13种，如2-芳基苯并呋喃类黄酮、羧酸及其衍生物等（图2D）。胚乳中有42个差异代谢物（16个上调，26个下调），分为16种，如2-芳基苯并呋喃类黄酮、香豆素及其衍生物等（图2E）。

图1 研究策略

图2 横向及纵向比较的差异代谢物及其类别

多代a[CO2]小麦颖果

胚芽和胚乳空间氨基酸谱的比较分析

由于氨基酸在植物发育中的重要性，作者对小麦颖果的氨基酸展开研究，发现a[CO2]下小麦颖果含有四种必需氨基酸，包括异亮氨酸（m/z 132.1019）、赖氨酸（m/z 147.1126）、苏氨酸（m/z 118.0498）和缬氨酸（m/z 140.0681），主要出现在小麦颖果的胚芽中，而它们在胚乳中的丰度要比胚芽中的丰度低，但缬氨酸在胚乳周围显示出轻微的聚集（图2C）。

a[CO2]下小麦颖果的胚芽中只有两种不同的半必需氨基酸，即精氨酸（m/z 175.1188）和酪氨酸（m/z 180.0658）（图3 E和F），同样，二者在胚乳中的丰度也要高于胚芽。此外，研究发现，a[CO2]下小麦颖果中三种非必需氨基酸（谷氨酸（m/z 146.0449）、谷氨酰胺（m/z 145.0609）和组氨酸（m/z 154.0611）在胚和胚乳之间出现了不均匀的分布，它们主要分布在胚芽中（图3G，H和I）。而在胚芽中也发现了氨基酸类似物如4-胍基丁酸（m/z 146.0922）、γ-氨基丁酸（m/z 104.0710）、哌酮酸（m/z 130.0862）、焦谷氨酸（m/z 128.0342）和谷胱甘肽（m/z 306.0767）。

图3 a[CO2]下小麦颖果中必需、半必需及非必需

氨基酸在胚芽和胚乳中的分布

为了评估多代e[CO2]暴露在氨基酸谱系中引起的胚-胚乳可塑性，使用AFADESI-MSI显示空间分布并计算理论丰度与多代a[CO2]暴露相比，多代e[CO2]暴露引起胚芽和胚乳之间11种氨基酸的空间分化。必需氨基酸，苏氨酸（m/z 118.0498）、异亮氨酸（m/z 130.0863）和赖氨酸（m/z 147.1126）在多代e[CO2]暴露下的胚芽中分布显著，苏氨酸和赖氨酸在胚芽中的丰度分别比胚乳高5倍、4倍和9倍（图4A、B和D；表S2）。

另外两种必需氨基酸，即缬氨酸（m/z 140.0681）和苯丙氨酸（m/z 164.0707），不仅在胚芽中有大量分布，而且在胚乳中也有少量分布（图4B、C和E），半必需氨基酸，尽管在多代e[CO2]暴露下，精氨酸（m/z 175.1188）和酪氨酸（m/z 180.0658）主要分布在胚芽中，但酪氨酸在胚乳中仍有少量分布（图4F和G）。

研究中发现，所有非必需氨基酸在胚芽中都表现出明显的高水平，除了天冬氨酸。

图4 e[CO2]下小麦颖果中必需、半必需及非必需

氨基酸在胚芽和胚乳中的分布

多代e[CO2]对小麦颖果中

氨基酸空间分布的影响

为了进一步探讨多代e[CO2]暴露是否会影响代谢物的分布，对不同CO2水平下的小麦颖果的MS图像进行了统一的分析。与连续的a[CO2]处理相比，多代e[CO2]导致缬氨酸（m/z 140.0681）水平明显偏低，同时胚芽中丰富的非必需氨基酸包括谷氨酰胺（m/z 145.0609）、谷氨酸（m/z 146.0449）和组氨酸（m/z 154.0611）也有所下降（图5 A, D, E 和 F）。在暴露于多代e[CO2]的小麦颖果的胚芽中，赖氨酸和天冬氨酸的丰度与多代a[CO2]相比没有明显差异（图5 B和C）。相比之下，两种氨基酸表现出不同的模式，在多代e[CO2]下，胚乳中天冬氨酸（m/z 132.0292）和谷氨酸（m/z 146.0449）的丰度明显增加（图5 C和E）。在氨基酸类似物方面，只有焦谷氨酸（m/z 128.0342）受到多代e[CO2]的影响，表现为小麦颖果胚芽中的数量减少（图S3A）。

图5 a[CO2]和e[CO2]下小麦颖果中必需及非必需

氨基酸在胚芽和胚乳中的分布比较

多代e[CO2]对小麦颖果中

有机酸空间分布的影响

小麦颖果中有机酸的功能和分布很少被研究。在多代a[CO2]条件下，除苹果酸（m/z 133.0132）没有明显变化外，所有在小麦颖果的胚芽和胚芽之间不同分布的有机酸都显示出丰度的明显下降（图6 A-E）。然而，只有抗坏血酸（m/z 175.0240）在多代e[CO2]下的小麦颖果中表现出不均匀的模式，这主要体现在胚芽中（图6 B）。这说明，多代e[CO2]暴露对胚乳和胚芽中的有机酸都有明显的影响。

图6 a[CO2]和e[CO2]下小麦颖果中

有机酸在胚芽和胚乳中的分布比较

研究结论

在连续的a[CO2]下，异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、精氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和组氨酸等9种差异表达的氨基酸呈现出胚芽分布模式。胚芽中缬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和组氨酸的丰度因多代e[CO2]而下降，而赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸在胚乳中的丰度出现了不同的趋势，表明在未来的高CO2世界中，膳食健康可能会被抑制，多代e[CO2]暴露抑制了种子发芽的能量储存，而胚乳动员在这种情况下发挥了重要作用。除了氨基酸，多代e[CO2]降低了抗坏血酸和顺式乌头酸的丰度，而增加了胚乳中苹果酸的丰度，不管是在胚和胚乳中。胚乳中苹果酸含量的增加可能有助于促进TCA循环，为子代的活力提供原料和能量。该研究通过空间解析代谢组学为e[CO2]对小麦种子的长期影响提供了新的见解，这可能会进一步影响小麦的人类营养和后代的活力。

本项研究主要使用AFADESI对暴露在多代e[CO2]下的小麦颖果的代谢物分布展开研究，并发现氨基酸和有机酸的分布存在组间（e[CO2]和a[CO2]）和组内（胚芽和胚乳）的差异。空间代谢组可以在保证样本完整的前体下，根据样本的特征部位，如植物种子的胚芽和胚乳，动物样本的癌和癌旁，进行区域间的代谢物差异分析，进而深入了解样本内部微区代谢的异质性，也可以根据代谢物的区域特异性分布，区分开同一样本的不同部位。因此，空间代谢组可以为类似研究提供有力支持和帮助。

鹿明生物提供优质的空间代谢组服务

空代仪器平台：已搭建2套AFADESI-MSI质谱成像系统+1套Waters DESI-MSI质谱成像系统；

项目执行：已落地执行项目百余项、检测组织样本类型20+；

定性算法经过多维校准:定性结果同时考虑物质表达空间情况、加和离子及同位素峰表达强度相似性、同位素表达空间分布相似性、非靶向质谱数据和空代自建数据库进行校准。

项目实测结果:可实现定性代谢物数量：1000-3000个代谢物;

无偏好性检测代谢物：:70%为700Da以下的小分子物质;30%为脂质类物质，更加适合代谢组学研究方向；

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